Interpretación de patología clínica en perros y primates no humanos en estudios preclínicos

perros yprimates no humanos (PNH), en particular los perros Beagle y los macacos cynomolgus o rhesus, son modelos animales grandes esenciales en el desarrollo preclínico de fármacos. Sus similitudes fisiológicas con los humanos proporcionan un valor traslacional para la seguridad, la farmacología y la evaluación de biomarcadores.

A diferencia de los roedores, los animales grandes admiten muestras de sangre repetidas y volúmenes de muestra más grandes, lo que permitefarmacocinética (PK), toxicocinético (TK)y evaluaciones de patología clínica. Sin embargo, la interpretación de los datos de patología clínica en estas especies se ve confundida por la variabilidad biológica, el diseño del estudio, el origen animal y los procedimientos experimentales. Para distinguir la toxicidad verdadera relacionada con el artículo de prueba-de la deriva fisiológica o los artefactos de procedimiento se requiere una comprensión integral de estas variables.

En estudios con animales grandes, el tamaño de las cohortes es inherentemente limitado debido a limitaciones éticas y prácticas. En consecuencia, los datos de referencia previos a la dosis son fundamentales. La realización de múltiples evaluaciones previas-a la dosis permite a los investigadores:

• Establecer cada animal como su propio control longitudinal.
• Cuantificar la variabilidad biológica individual.
• Identifique y excluya animales atípicos o no saludables antes de la aleatorización.
• Diferenciar las respuestas de estrés inducidas por el manejo-de la fisiología inicial.

La variación individual es particularmente pronunciada en los PNH en comparación con los roedores o perros criados-específicamente. Las anomalías iniciales a menudo incluyen parámetros fluctuantes de eritrocitos, elevaciones esporádicas de las enzimas hepáticas o perfiles proteicos atípicos. Si estas variaciones iniciales se superponen con el objetivo farmacológico previsto o el perfil toxicológico del artículo de prueba, la detección previa a la dosis sirve como mecanismo principal para evitar interpretaciones falsas-positivas.

La flebotomía frecuente para el perfil farmacocinético puede inducir cambios hematológicos iatrogénicos. La extracción de sangre con alta-frecuencia o alto-volumen provoca con frecuencia disminuciones en:

• Recuento de glóbulos rojos (RBC)
• Concentración de hemoglobina (Hgb)
• Hematocrito (Hct)
• Proteínas totales y albúmina (debido a hemodilución)

Si la función de la médula ósea permanece intacta, estos cambios microcíticos o normocíticos suelen ir acompañados de una reticulocitosis compensatoria. Por lo tanto, las disminuciones leves en los parámetros de eritrocitos deben cotejarse-con los volúmenes de sangre totales extraídos durante todo el estudio.

Los protocolos del NHP requieren habitualmente anestesia para inmovilización, obtención de imágenes o muestreo invasivo. La elección y la duración de la anestesia influyen directamente en las lecturas de patología clínica. Los animales anestesiados frecuentemente exhiben distribuciones de leucocitos alteradas y perfiles de electrolitos desplazados en comparación con cohortes conscientes e inmovilizadas manualmente. Además, el decúbito y las inyecciones de anestésicos intramusculares pueden causar un traumatismo muscular subclínico, lo que provoca picos marcados en la creatina quinasa (CK). Las técnicas de muestreo consistentes y los protocolos anestésicos estandarizados son obligatorios en todas las fases del estudio.

Las variables adicionales del diseño del estudio que requieren un control estricto incluyen:

• Edad animal y etapa de desarrollo.
• Duración del ayuno y momento en relación con la recolección.
• Orden de muestreo dentro de una cohorte
• Vía y ritmo de administración.
• Procedimientos experimentales compuestos (p. ej., dosificación quirúrgica, infusiones continuas)

Los perros y los NHP poseen una vida útil de eritrocitos más larga que los roedores, lo que altera la cinética del desarrollo de la anemia y la recuperación de la médula. Después de una pérdida aguda de sangre, los animales grandes demuestran un porcentaje de reticulocitos basal más bajo y una respuesta regenerativa más gradual.

En los macacos, las características basales de los eritrocitos (como el volumen corpuscular medio) se correlacionan con el origen geográfico (p. ej., monos cynomolgus chinos, camboyanos y mauricianos). La utilización de animales de una única fuente geográfica minimiza el ruido de referencia. Además, los patógenos de fondo subclínicos (como los hemoparásitos o las infecciones virales latentes) pueden suprimir la eritropoyesis y deben descartarse durante la cuarentena.

Los perfiles de leucocitos son muy específicos-de especie. Los perros tienen predominio de neutrófilos-, mientras que los NHP sanos exhiben una distribución más equilibrada o dominante de linfocitos-. Estas diferencias iniciales dictan patrones de manifestación distintos durante la inflamación sistémica.

Además, la restricción física, los entornos nuevos o el miedo desencadenan una rápida liberación de catecolaminas y glucocorticoides. Esta respuesta al estrés induce una movilización marginal del grupo, que se presenta como neutrofilia y linfopenia transitorias. Debido a que los NHP son muy sensibles al manejo del estrés, los cambios aislados en los recuentos de glóbulos blancos-sin signos clínicos correlativos o evidencia histopatológica de inflamación del tejido-deben interpretarse con precaución.

La cinética de la coagulación varía según la especie. El tiempo de protrombina (TP) inicial es inherentemente más corto en perros que en humanos, y las deficiencias idiosincrásicas de factores pueden causar una prolongación aislada y no-de fármacos-en perros individuales. En los estudios de NHP, los ensayos de tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA) son muy sensibles a la variabilidad del lote de reactivos y al manejo de las muestras (p. ej., coagulación parcial durante la recolección). Cuando la cascada de coagulación es un objetivo conocido del artículo de prueba, es imperativo que los lotes de reactivos sean uniformes y que coincidan estrechamente con las líneas base.

La alanina aminotransferasa (ALT) es un biomarcador estándar de fuga hepatocelular. En perros Beagle jóvenes,-criados específicamente, los rangos iniciales de ALT son estrechos, lo que permite la detección de cambios hepáticos sutiles inducidos-por el tratamiento. Por el contrario, los perros mayores y los NHP muestran una variación fisiológica más amplia.

Los macacos frecuentemente presentan picos de ALT transitorios y autolimitados debido a cambios hepáticos de fondo o brotes virales subclínicos. En consecuencia, las elevaciones de un solo punto-en las enzimas hepáticas requieren corroboración mediante biomarcadores concurrentes (p. ej., aspartato aminotransferasa, ácidos biliares totales), ensayos funcionales y evaluación histopatológica.

La fosfatasa alcalina (ALP) y la gamma-glutamil transferasa (GGT) sirven como indicadores de enfermedad hepatobiliar o colestásica. Si bien la FA es muy sensible a la colestasis en perros, es menos específica en los NHP debido a importantes contribuciones de isoenzimas óseas e intestinales, particularmente en animales jóvenes en crecimiento. La GGT suele ser un marcador biliar más fiable en los modelos NHP.

El nitrógeno ureico en sangre (BUN) y la creatinina sérica siguen siendo los indicadores estándar de la filtración glomerular, a pesar de su insensibilidad a la insuficiencia renal en etapa temprana-. Los perros mantienen rangos fisiológicos relativamente estrechos para estos analitos, lo que simplifica la identificación de cambios renales leves. Por el contrario, los NHP presentan un amplio rango de referencia, lo que hace que los cambios sutiles sean más difíciles de caracterizar.

Debido a que el BUN está influenciado por el catabolismo de las proteínas, la ingesta dietética y el estado de hidratación, debe interpretarse junto con la creatinina. El análisis de orina proporciona un contexto esencial, pero la recolección de muestras en animales grandes-que a menudo implica la recolección durante la noche en recipientes-presenta riesgos de evaporación, contaminación fecal o degradación celular. Cuando la nefrotoxicidad es una preocupación principal, se recomienda una cistoscopia cronometrada guiada por ultrasonido-o una jaula metabólica especializada.

Las elevaciones de la creatina quinasa (CK) son comunes en los estudios de NHP. Con frecuencia son impulsados ​​por captura física, inmovilización, inyecciones intramusculares o decúbito prolongado bajo anestesia en lugar de toxicidad sistémica del artículo de prueba. Para evitar interpretaciones erróneas, los picos aislados de CK deben evaluarse frente a:

• Proximidad cronológica a eventos estresantes o inyecciones.
• Clara dependencia-de la dosis entre los grupos de tratamiento
• Co-activación de marcadores tisulares más específicos
• Cambios concurrentes en aspartato aminotransferasa (AST) y lactato deshidrogenasa (LDH)

Para las evaluaciones de cardiotoxicidad, se deben utilizar troponinas cardíacas (I o T), ya que ofrecen una cardioespecificidad superior a los marcadores enzimáticos tradicionales tanto en perros como en NHP.

El metabolismo de la glucosa y los lípidos en los NHP es muy sensible a los factores estresantes ambientales y a los cambios dietéticos. La manipulación-de la liberación de epinefrina inducida de forma rutinaria desencadena una glucogenólisis rápida, lo que produce una hiperglucemia transitoria. Los horarios de alimentación también provocan fluctuaciones pronunciadas en los triglicéridos y el colesterol séricos.

Los NHP también exhiben concentraciones basales de proteína sérica más altas y más variables que los roedores. Los cambios en las fracciones de albúmina y globulina frecuentemente reflejan respuestas inflamatorias de fase aguda-no-específicas-a procedimientos, infecciones subclínicas o estados nutricionales alterados, en lugar de toxicidad directa-en órganos diana.

Las concentraciones séricas de electrolitos, particularmente sodio, potasio y cloruro, están sujetas a cambios rápidos en los NHP debido al estado de hidratación, desequilibrios ácido-base debido a la depresión respiratoria inducida por la anestesia- o hemólisis de la muestra.

Las concentraciones de calcio total están unidas directamente a la albúmina sérica. En consecuencia, las alteraciones del calcio total deben corregirse matemática o fisiológicamente según los niveles de albúmina; Los cambios en el calcio total no necesariamente indican un cambio biológicamente relevante en la fracción funcional de calcio ionizado.

La interpretación de datos de patología clínica en perros y primates no humanos va más allá de las comparaciones estadísticas estándar entre los grupos de vehículo y tratamiento. La variabilidad biológica, la deriva de la línea base, los artefactos de la flebotomía, la anestesia y el estrés por manipulación frecuentemente introducen datos confusos.

La evaluación precisa de la seguridad se basa en la integración holística de los parámetros de patología clínica con los parámetros de diseño del estudio, las observaciones clínicas en tiempo real-, los datos de exposición farmacocinética y los resultados histopatológicos definitivos. Un enfoque riguroso y específico-de cada especie para estos conjuntos de datos es esencial para traducir los hallazgos preclínicos en evaluaciones precisas del riesgo humano.

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Hall, RL y Everds, NE (2003). Factores que afectan la interpretación de la patología clínica de primates caninos y no humanos.Patología toxicológica, 31(1_suppl), 6-10. DOI: 10.1080/01926230390174878